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细胞粉碎机对核桃楸树皮提取物的抗肿瘤作用

[导读]研究核桃楸树皮提取物的抗肿瘤作用。方法:以超声波辅助及减压蒸馏法浸提核桃楸树皮, 用核桃楸树皮提取物对S180 肉瘤和H 22 肝荷瘤小鼠进行体内、体外抑瘤实验, 并与空白对照组进行比较。

  核桃楸(J ug lans mandshurica Maxim)又名胡桃楸、山核桃、小核桃等, 为胡桃科胡桃属落叶乔木。主要分布于我国东北地区, 甘肃、四川等地也有少量分布。核桃楸是我国重要的药源植物, 据史料记载,其树皮、根皮、叶片、未成熟外果皮及外壳均可入。现代研究表明, 核桃楸具有抗菌、消炎、抗癌等作用, 特别是抗肿瘤作用尤为显著, 核桃楸各部位的提取物治疗癌症早已有广泛应用, 其化学成分中的胡桃醌(juglone 5-hydrox y-1 , 4-naphthoquinone)为其抗肿瘤主要活性成分之一 。在我国民间广泛流传用胡桃楸树皮煮水喝治疗肿瘤。报道胡桃醌可直接抑制体外培养肿瘤细胞的增殖。但目前尚无对核桃楸树皮提取物抗肿瘤活性的临床研究报道。本实验选用S180 肉瘤和H22 肝荷瘤小鼠作为研究对象, 观察核桃楸树皮提取物的抗肿瘤效应, 为核桃楸树皮提取物的临床应用提供理论依据。

材料

  JY96 -IIN 超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);DG5033A 酶联免疫检测仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司);RPMI 1640 培养液(美国Gibco 公司);四甲基偶氮唑盐(M TT , 华美生物工程公司);二甲基亚砜(厦门星隆达化学试剂有限公司);环磷酰胺注射液(C TX , 江苏恒瑞制药有限公司, 批号08031021);核桃楸树皮样品(于2007 年6 月采自四川省汶川县三江乡中药材基地,树龄约20 年, 鉴定员300859);S180 瘤株(重庆医科大学海扶肿瘤治疗中心);H22 瘤株(重庆医科大学医学检验系);选用健康昆明种(KM)小鼠, 体质量19 ~ 23 g , 6 ~ 8 周龄, ♀♂兼用[ 重庆腾鑫生物技术有限公司, 动物合格证号:SCXK(渝)20020002] 。

方法

核桃楸树皮有效成分的提取

  精密称取核桃楸树皮样品1 000 g , 以水-乙醇溶液为浸提液, 浸提液体积与样品质量比为10∶1(mL/g)。在超声波功率为300 ~ 500 W , 温度30 ~ 50 ℃的条件下, 浸提10 ~ 30 min 。然后将超声波辅助浸提后的物料进行减压蒸馏。以氯仿萃取馏出液, 通过重结晶和色谱法对产品进行分离和纯化。得到棕黄色针状结晶820 mg(主要成分胡桃醌)。

核桃楸树皮提取物抑制小鼠S180 肉瘤的作用

 取接种8 d , 肿瘤生长良好且无溃破的腹水型S180荷瘤小鼠, 颈椎脱臼处死, 固定于蜡板上, 腹部皮肤用碘酊、乙醚消毒后, 取腹水(抽取出的腹水为乳白色的浓稠液体, 置无菌容器内冰块上保存, 取一滴于载玻片上, 推片, 瑞氏染色, 镜下进行细胞分类计数,其中瘤细胞数为97 .7 %)。用生理盐水稀释成1 ×107 个/mL 个瘤细胞的悬液, 接种于实验小鼠右前肢腋窝皮下, 每只小鼠接种0 .2 mL 瘤细胞悬液。将接种S180 肉瘤的小鼠随机分为空白对照组、实验用药组和环磷酰胺阳性对照组, 每组10 只, 标号并称重。接种S180 肉瘤细胞24 h 后, 空白对照组每只小鼠隔天连续灌胃给与实验组给药容积相等的生理盐水1 次;实验组每只小鼠隔天按50 , 100 , 200 mg ·kg-1剂量(剂量参照文献)灌胃给药1 次;阳性对照组给予环磷酰胺, 每只小鼠隔天按30 mg·kg -1剂量给药1 次, 腹腔注射。各组小鼠于实验的第12天, 分别颈椎脱臼处死, 完整剥出瘤体, 称重, 计算抑瘤率。计算方法:抑瘤率=(空白对照组瘤质量-用药组瘤质量)/空白对照组瘤质量×100 %。

  核桃楸树皮提取物抑制小鼠肝癌H22 的作用方法同上。

  核桃楸树皮提取物体外抗肿瘤作用 分别取接种8 d 生长良好且无溃破的腹水型S180 肉瘤小鼠和腹水型H22 肝癌的小鼠, 颈椎脱臼处死, 固定于蜡板上, 腹部皮肤用碘酊、乙醇消毒后, 取腹水。用含5 %新生胎牛血清RPMI 1640 培养液稀释成每毫升含1 ×106个瘤细胞的混悬液, 以每孔190 μL 接入96 孔培养板, 在37 ℃、100 %相对湿度、5 %二氧化碳、95 %空气的培养箱中预培养24 h 。取核桃楸树皮提取物, 配制成质量浓度分别为25 , 50 , 100 mg ·L-1的溶液;同时设环磷酰胺阳性对照组, 其质量浓度为30 mg·L-1 , 每孔分别加入10 μL 药液;阴性对照组加相应体积的含5 %新生胎牛血清RPMI 1640培养液。然后将以上各组再置于37 ℃、100 %相对湿度、5 %二氧化碳、95 %空气的培养箱中培养48 h后, 每孔加MT T 10 μL , 继续孵育4 h , 弃上清, 每孔加入二甲基亚砜150 μL , 轻轻振荡使甲臜完全溶解, 转至酶标板上, 570 nm 波长处测定吸光度(A)。2.5 统计学处理 不同实验间差异用t 检验, 采用S PSS 软件处理。

结果

  核桃楸树皮提取物对小鼠S180 肉瘤、小鼠肝癌H22的影响 由表1 可以看出, 核桃楸树皮提取物各剂量组与空白对照组比较有显著的抑瘤效果(P <0 .01), 且与剂量呈正相关


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