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细胞粉碎机在红球菌菌株腈水合酶提取方法的优化

[导读]研究了红球菌(Rhodoccus sp. Tccc28001)腈水合酶初步提取实验.

腈水合酶(NHase,EC 4.2.1.84)能通过水合反应将腈类物质转化成酰胺.这种生物催化剂符合绿色化工的需要,在生物转化中具有重要的研究和应用价值.腈水合酶是能催化带有-C≡N 功能基团的化合物的金属酶.其产物如丙烯酰胺和尼克酰胺等在饲料、化工、医药、造纸、树脂及纺织服装等领域具有广泛的应用.用腈水合酶生产酰胺类化学品具有成本低、能耗低及污染少等优点.红球菌(Rhodoccus sp.Tccc28001)菌株内的腈水合酶具有宽泛的底物谱,能水合脂肪腈、芳香腈和杂环腈,同时对二腈具有很强的区域选择性.因此,研究该菌腈水合酶的提取具有重要意义.



仪器与试剂

仪器与菌株

Agilent1100型高效液相色谱分析仪(美国Agilent公司);Kromasil 100-5 C18色谱柱,4.6 mm×250 mm(日本JEOL公司);超声细胞匀浆仪宁波新芝生物科技有限公司);TCL-12型台式高速冷冻离心机(Thermo公司,USA);Gilson微量取样器(Gilson Electronics公司,France);AB204-S型分析天平(Mettler Toledo公司).菌株Rhodoccus sp. Tccc28001(现名:Rhodococcus rube.CGMCC3090)分离于天津近郊受污染土壤样品,保藏于齐齐哈尔大学分子实验室.

培养基与缓冲液

  培养基的配制 实验采用的斜面培养基、种子培养基和发酵培养基的配制和使用均同文献.

  40 mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH7.2)的配制 首先配制100 mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH7.2):取6.8045 g KH2PO4 用蒸馏水定溶至500 mL 作为A1 液;另取22.822 g K2HPO4·3H2O 用蒸馏水定容至1 L 作为A2液.分别在121 ℃灭菌30 min,按A1与A2 体积比为283∶717 混合,即为100 mmol/L 磷酸缓冲液.用时取该缓冲液400 mL 加蒸馏水600 mL 即可.



实验方法

生长曲线测定和菌体酶活力测定

  根据红球菌的生长曲线确定培养时间.取10 个装有100 mL 发酵培养基并已接菌的250 mL 的三角瓶,按发酵培养条件培养,分别在12,24,36,48,60,72,84,96,108,120 h 取样,将细菌培养物稀释50倍,以同样稀释倍数的空白培养基作为对照,用UVmini-1240 紫外可见分光光度计在600 nm 波长处测定OD 值,以确定菌体的生长曲线.并对上述不同时间取样的培养液(菌悬液)进行相对酶活力检验.

菌体收获、重悬和超声处理

  96 h 培养后的发酵产物用高速冷冻离心机(4 ℃)8 000 r/min 离心30 min 收集菌体,菌体沉淀用40mmol/L 的磷酸钾缓冲液(pH7.2)洗涤2 次,得到菌体悬液.并用适量同样的缓冲液重悬菌体,进行超声破碎.超声波处理分为2 种情况:一种是超声前加入适当溶菌酶(每50 mL 菌悬液加入100 μL 溶菌酶,即100 μg/mL 溶菌酶,溶菌酶在4 ℃下处理菌悬液40 h),另一种不加溶菌酶.超声处理分2 次进行,每次30 min(15 s 超声,15 s 间隔;每个循环30 s 共60 个循环).

硫酸铵分级分离

  分别称取已在100 ℃烘干2 h 的硫酸铵0.106,0.146,0.206,0.291,0.361,0.436,0.516,0.603,0.697g 于1.5 mL 离心管中,各管放置于冰上,用移液枪分别移取1 mL 无细胞提取物加入其中,分别形成20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%饱和度的硫酸铵溶液(0 ℃),摇匀后放冰箱中静置4 h,备用.取出后在4 ℃,12 000 r/min 离心20 min,收集沉淀,沉淀用同样体积的40 mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH7.2)重悬.测定腈水合酶相对酶活力,得硫酸铵分级盐析曲线,从而确定硫酸铵分级盐析的最佳条件.

透析除盐

  把截留分子量为10 kD 的透析袋剪成适当长度(10~20 cm)的小段备用.在大体积1 mmol/L EDTA(pH8.0)的溶液中将透析袋煮沸10 min,用蒸馏水彻底清洗透析袋.分别将上述硫酸铵分级分离重悬液装入其中,两端夹紧后放入1 000 mL 25 mmol/L 磷酸缓冲液(pH7.2)中进行透析.用磁力搅拌器缓慢搅拌以促进溶液交换.之后放入4 ℃冰箱透析数小时,以达到透析平衡,更换透析缓冲液数次,使原有缓冲液中的盐成分逐渐减少,以便测定腈水合酶活力.

腈水合酶相对酶活力测定

  转化液的制备和产物浓度的测定:每次取一定稀释度的100 μL 菌悬液(或粗酶液)加入到1.4 mL 含8%烟腈溶液的1.5 mL 离心管中,28 ℃震荡5 min,加入20 μL 5 mol/L HCl 终止反应.转化液12 000 r/min离心15 min,用0.22 μm 水相滤膜过滤,把转化液进行一定倍数的稀释,进样量为20 μL.采用Kromasil 100-5C18 色谱柱,在高效液相色谱(HPLC)上检测烟酰胺的峰面积.检测器为G1322ADEGASSER G1314VWD检测器,检测波长为260 nm,柱温为30 ℃;流动相比例为甲醇∶冰乙酸∶水=30∶1∶70,流速为1 mL/min.在上述色谱条件下,测得不同标准样的峰面积,以峰面积的百分比代表腈水合酶的相对酶活力.



讨论

  本研究对Rhodoccus sp.Tccc28001 细胞内腈水合酶的提取方法进行了优化,获得了红球菌细胞的最佳培养条件和最佳收获时间;研究了超声破碎处理方法,比较了加入溶菌酶和不加溶菌酶对超声处理的影响,获得了最佳超声方法;进行了硫酸铵沉淀方法的优化;最后获得了最高酶活力腈水合酶的粗提方法,为今后对腈水合酶通过层析方法进行纯化奠定了基础,也为后续研究腈水合酶的酶学性质提供了数据.



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