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灰树花多糖的分离纯化

[导读]利用超声破碎、水提醇沉、葡聚糖凝胶过滤层析等方法,对灰树花子实体多糖进行分离得到多糖组分GFD-1。

  灰树花[Grifola frondosa(Dicks,ex Fr)S.F.Gray],又名贝叶多孔菌、千佛菌、栗子蘑、云蕈、莲花菌等,日本称之舞茸,美国称之林鸡,隶属担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、树花菌属,其肉质脆嫩,味如鸡丝,营养丰富,且含有生物活性物质,能烹调出各种美味菜肴,是近年来开发的一种研究价值的食药两用菌。由于其产量大、栽培简单,目前在全球各地广泛分布。上世纪80 年代以来,国内外学者从灰树花菌丝体和子实体中提取了包括MT-2、MD-组分、D-组分、Grifolan、X-组分和LELFD 在内的数十种活性多糖,结果表明其具有明显的生理活性,主要包括抗肿瘤、抗HIV 病毒、降血糖及增强免疫力功能等,已成为生物学、药学和食品科学等各研究领域的热点。肿瘤是严重危害人类生命的疾病,其死亡率仅次于心血管疾病,因此对肿瘤的研究一直是医药学重点内容之一。肝细胞癌(HCC)是死亡的第三大常见原因癌,手术仅能治疗很小一部分患者的病症,而如此高的死亡率及低治愈率,使得找到有效预防及治疗肝癌的控制剂变得十分必要。现阶段对灰树花多糖的抗肿瘤活性研究主要集中于肺癌、卵巢癌、膀胱癌等作用;但针对抗肝癌活性研究的报道还较少。本研究分离纯化出一种具有明显抗肝癌(HepG2)活性的均一灰树花多糖组分GFD-1,并集中对其结构和抗肝癌活性进行了研究,为进一步深入研究其构效关系和生物活性提供一定的理论参考。



材料与方法

材料与仪器

  灰树花子实体:购自浙江庆元黄田食用菌种植基地;人体正常肝细胞L-02:购自中国医科大学,天津科技大学食品卫生与安全研究室保存;人体肝癌细胞株HepG2:天津医科大学馈赠,天津科技大学食品安全与卫生研究室保存。VECTOR22 傅立叶变换红外光谱仪:德国布鲁克仪器公司;Scientz-10N冷冻干燥机宁波新芝生物科技股份有限公司;高效液相色谱仪:日本岛津;TS100 倒置相差显微镜:日本Nikon;MK-3 酶标仪:Thermo。

试剂

  葡聚糖凝胶、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、核糖核酸酶溶液:Sigma;杜尔伯科改良伊格尔高糖培养基:Hyclone;胎牛血:Gibco;碘化丙啶(PI)、溴化乙锭(EB)、吖啶橙(AO):Amresco;其他试剂均为国产分析纯。



方法

灰树花子实体多糖的提取

  取灰树花子实体烘干、粉碎,将其粉末溶于80 ℃热水(料液比1 ∶ 20,g/mL)超声60 min;90 ℃热水浸提10 h,将提取液以7 000 r/min 离心10 min;重复离心两次收集上清,将溶液浓缩至原溶液体积的2/5~3/5 后加入3 倍体积80 %乙醇,4 ℃过夜,醇沉;将此溶液7 000 r/min 离心20 min,收集醇沉物,经无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤后冷冻干燥得子实体多糖粗品。

灰树花子实体多糖的分离纯化

  取灰树花粗多糖溶于水,采用Sevage 法脱蛋白,将脱色后的多糖溶液装于超滤杯中,以0.2 MPa 左右的压力通过截留分子量为10 kDa 的超滤膜,将超滤杯中的溶液继续以0.2 MPa 左右的压力通过截留分子量为50 kDa 的超滤膜继续超滤,收集两组分即粗略制得分子量在10 kDa 至50 kDa 多糖溶液。多糖溶液离心,取上清经0.45 μm 微孔滤膜过滤。上样于Sephadex-G75 色谱柱(26 mm×300 mm),每10 min 收集一管,利用苯酚-硫酸法测定各管多糖含量,合并洗脱峰并真空浓缩冷冻干燥,得多糖均一组分(GFD-1)。

  灰树花多糖GFD-1 相对分子质量测定将GFD-1 样品制成10 mg/mL 多糖溶液,用0.22μm的微孔滤膜过滤备用,采用高效凝胶渗透色谱法(HPLC)检测其相对分子质量。选用分离葡聚糖的分子量范围为10 kD~80 kDa 的Shodex OHpak SB-803HQ 凝胶色谱柱,以三蒸水为流动相,调整流速为0.8 mL/min,设定柱温30 ℃,待基线平稳后,上样10 μL,示差检测器检测。

  灰树花多糖GFD-1 理化性质的测定采用斐林试剂反应、双缩脲反应、硫酸咔唑反应、碘反应、三氯化铁反应、苯酚硫酸法对灰树花多糖GFD-1 组分进行理化性质的测定分析。

  紫外扫描(UV)将多糖样品配制成1mg/mL 的溶液,在波长190 nm~400 nm 范围内进行扫描。

  红外光谱定性分析(IR)将玛瑙研钵用蒸馏水洗净、自然干燥,加入100 mg干燥的KBr 研磨成细粉,实验组加入1 mg GFD-1 多糖样品混合均匀研磨至2 μm 以下的颗粒。在擦拭干净的压片模具里放入研磨好的粉末,将其堆积成中间高、四周低的小山形,加压约15 s 制成透明薄片。以纯KBr 薄片为空白,测空白背景,再将试样薄片置于光路中,测定样品红外光谱。

  原子力显微镜(AFM)观察GFD-1 结构[9]将云母片表层撕去,用乙醇及超纯水进行清洗、晾干。将多糖样品用超纯水配制成100 μg/mL 的溶液点在云母片上,置于干燥器中晾干后,在原子力显微镜下观察并在轻敲模式下记录结果。

  灰树花多糖GFD-1 抗肿瘤活性研究细胞体外增殖抑制实验(MTT)待培养结束后,将96 孔板从培养箱中取出,向各孔中加入0.5 mg/mL MTT 溶液20 μL,继续置于培养箱中培养4 h 后,吸去上清液,每孔加入DMSO 150 μL,充分振荡酶标板使甲臜溶解;用酶标仪检测各孔吸光度A 值,检测波长为570 nm,参比波长为630 nm。抑制率/%= A 对照组-A 试验组A 对照组×100 (1)式中:A 对照组为未经GFD 作用的细胞吸光度值;A试验组为利用GFD-1 作用细胞组的吸光度值。

  灰树花多糖GFD-1 抗肿瘤形态学观察(AO/EB)双染细胞培养结束后,用70 %的冰乙醇固定15 min,加入等体积混合的AO、EB 染色液于37 ℃避光孵育20 min,用PBS 洗去残留染液,沥干液体,盖在载玻片上用LSCM 观察细胞形态变化并采集细胞图像。

  流式细胞术分析细胞凋亡率及细胞周期[11]待培养结束后,用70 %冰乙醇4 ℃固定18 h,用核糖核酸酶溶液(1.0 g/L)在37 ℃水浴中处理30 min后,加入75 μmol/L 碘化丙啶(PI)250 μL,4℃避光染色30 min,流式细胞仪对着色细胞进行分选检测并检测细胞凋亡率,激发波长为488 nm,发射波长为630 nm。



结论

  通过水提醇沉、冻干、脱蛋白及超滤分离后经过Sephadex G-75 葡聚糖凝胶柱色谱得到灰树花多糖单一组份GFD-1。通过高效液相色谱证明GFD-1 为性质均一的多糖类物质,并且测定了多糖分子量。利用显色实验、紫外光谱、红外光谱及原子力显微镜初步分析该均一多糖组分GFD-1 为不含还原性羰基、酚羟基、游离或结合的蛋白质、核酸类物质的非淀粉类α-吡喃多糖,糖链高度在0.5 nm~1 nm 左右。细胞体外增殖抑制实验(MTT)表明GFD-1 在一定浓度范围内能够显著抑制肝癌细胞株HepG2 的生长,并呈时间依赖,IC50 为94 μg/mL;用相同浓度GFD-1分别作用HepG2 细胞和人体正常肝细胞L-02 时,GFD-1 对人体正常肝细胞影响较小,即GFD-1 可以选择性地抑制肝癌细胞和人体正常细胞。流式细胞术(FCM)检测经GFD-1 处理的HepG2 细胞发生了S 期阻滞,并诱导细胞发生凋亡。通过染色对细胞进行形态学观察发现:GFD-1 作用HepG2 细胞后,细胞呈现出明显的凋亡形态学改变,即GFD-1 能诱导HepG2细胞发生凋亡。

  灰树花多糖构效关系有待进一步深入研究,拟在本实验研究基础上,对灰树花多糖的单糖组成及其连接方式等进行后续研究,阐明灰树花多糖的构效关系,从而为灰树花多糖的深度开发利用提供科学参考。








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