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裂殖壶菌油脂的提取

[导读]采用酶法辅助超高压均质技术提取裂殖壶菌油脂,考察了破碎次数、菌体浓度、破碎 压力、酶用量对毛油提取率的影响。

  二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,简称DHA)是重要的ω-3多不饱和脂肪酸,俗称“脑黄金”,具有促进脑细胞生长发育、保护视力、防治心血管疾病、抗癌及调节免疫能力等多种重要的生理功能。由于人体自身难以合成DHA,必须从体外摄入。深海鱼油是DHA的传统来源,但其品质易受到鱼的种类、季节和地理位置等的影响,此外,还存在DHA含量低、脂肪酸组成复杂、有鱼腥味和海洋污染物等缺点,难以满足市场需求。海洋真菌裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)具有生长速度快、易于培养和DHA含量高等优势,已被证实是理想的DHA生产菌株之一裂殖壶菌的脂质主要存在于由细胞壁所包裹的菌体细胞内。为了提取胞内油脂,需要对细胞进行破壁。不同的细胞破碎方法直接影响到油脂的产量、品质及生产成本。因此,开发低成本、高效的细胞破碎技术是实现DHA油脂大规模生产亟待解决的关键问题之一。

  目前,已报道的裂殖壶菌细胞破碎方法主要有:物理法(研磨法、均质法、超声波法、冻融法和微波法)、化学法(酸法、碱法)和生物法(酶法)。其中,超声波法、冻融法和微波法仅适用于实验室处理少量样品,难以实现工业化应用;酸法中由于使用浓盐酸含有氯离子,会造成不锈钢设备的腐蚀。因此,工业上常使用研磨法、均质法、酶法或2种以上相结合的方法来破碎细胞。超高压均质技术(Ultra-High PressureHomogenization,简称UHPH)是基于传统均质技术发展起来的一种非热加工技术,压力一般在60MPa以上,最高可达400 MPa。在UHPH处理过程中,利用超高压能量使样品通过狭缝瞬间释放,在剪切效应、空穴效应、碰撞效应的作用下,使细胞破碎。因全过程在(4~6)℃的低温循环水浴中进行,可保持原有物质活性和性能,现已应用于红色诺卡氏菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、雨生红球藻、小球藻、酵母等破壁研究中。

  本研究采用酶法辅助超高压均质技术提取裂殖壶菌油脂,先利用超高压均质技术对裂殖壶菌发酵液进行预破碎处理,考察了菌体浓度、破碎压力和破碎次数等条件对毛油提取率的影响;在优化条件下,考察酶法辅助提取裂殖壶菌油脂的效果和稳定性,为其工业化应用提供参考。

材料与方法

材料与试剂

  裂殖壶菌:本实验室保藏;正己烷、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠等:分析纯,天津市大茂化学试剂厂;粉状碱性蛋白酶(最适条件:pH为9.5,温度为55 ℃):南宁庞博生物工程有限公司;液体碱性蛋白酶(最适条件:pH为10.5,温度为45 ℃):南宁东恒华道生物科技有限责任公司。

主要仪器设备

  JG-1A高压细胞破碎机:宁波新芝生物科技股份有限公司;PB-10 pH计、PRACTUM1102-1CN电子天平:赛多利斯公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器:巩义市予华仪器有限责任公司;CR 22GⅡ高速冷冻离心机:日本HITACHI公司;RV 10旋转蒸发仪:德国IKA公司;Milli-Q Direct 8纯水超纯水一体机:密理博中国有限公司。

实验方法

 工艺流程 裂殖壶菌液→超高压均质破碎→酶解→正己烷萃取分离→旋转蒸发除去溶剂→毛油称重。

单因素实验

  破碎次数对毛油提取率的影响 固定温度为4 ℃,在破碎压力为200 MPa,菌体浓度分别为200 g/L(湿重)和250 g/L(湿重),破碎次数分别为1次、2次、3次的条件下提取毛油。

  菌体浓度对毛油提取率的影响 固定温度为4 ℃,在破碎压力为200 MPa,破碎次数为1次,菌体浓度分别为200 g/L(湿重)、250 g/L(湿重)、300 g/L(湿重)、350 g/L(湿重)、400 g/L(湿重)的条件下提取毛油。

  破碎压力对毛油提取率的影响 固定温度为4 ℃,在菌体浓度为200 g/L(湿重),破碎次数为1次,破碎压力分别为100、150、200 MPa的条件下提取毛油。

  酶法辅助方法 取超高压均质破碎后的菌液,用1 mol/L的NaOH溶液调节pH,先加入0.25%、0.5%、1%的酶,置于250 mL圆底烧瓶中,中速搅拌,恒温酶解3 h。根据毛油提取率的效果,再加入2%、4%、6%的酶,进行酶解反应3 h。

  酸热法 称取一定量的菌液至圆底烧瓶中,按照v(浓盐酸)/v(菌液)=4/3的比例加入浓盐酸,置于70 ℃恒温水浴中,搅拌反应50 min后结束,冷却降温至室温。将反应液转移至分液漏斗,加入等体积正己烷充分振荡混匀,静置分层后取正己烷层移至蒸发瓶,旋蒸至恒重,称量。

  毛油提取率 用恒重蒸发瓶收集萃取的油脂,旋转蒸发除尽溶剂后称重记为m。提油率(Y)计算公式为:Y(%)=(m/W)×100式中:

Y为毛油提取率,%;

m为毛油质量,g;

W为裂殖壶菌中的油脂理论量(由酸热法测定),g。

结论

  超高压均质技术全过程在(4~6)℃的低温循环水浴中进行,可使裂殖壶菌油脂避免在高温条件下发生变化,同时连续进样、出样,破碎效率高。酶法破壁条件温和,设备简易,但需要较长时间。2种或以上方法相结合来破碎裂殖壶菌将成为今后的发展趋势。通过对破碎次数、菌体浓度、破碎压力等单因素实验,得出超高压均质技术提取裂殖壶菌油脂的最优条件为:菌体浓度为200 g/L(湿重),压力为200 MPa下破碎1次,在此条件下毛油提取率为80%。菌液经过超高压均质后再酶解,添加2%的液体碱性蛋白酶,在其最适条件下酶解反应3 h后,毛油提取率可达92.12%,该复合法为裂殖壶菌油脂工业化提取提供了参考。但该复合法的最适菌体浓度仅为200 g/L(湿重),与实际生产时的菌体浓度相比偏低,如若采用此法,还需将实际菌体浓度稀释至200 g/L(湿重),这也是该复合法今后仍需改进的地方。



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