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破壁灵芝孢子粉的制备

[导读]通过比较不同的破壁技术对灵芝孢子破壁率及有效成分溶出的影响,以期建立灵芝孢子的高效破壁工艺,并考察破壁灵芝孢子粉对小鼠免疫功能的影响。

  灵芝(Ganoderma lucidum)是担子菌纲、多孔菌科药食两用真菌,在我国传统中医药中主要以子实体入药,临床上主要用于治疗慢性支气管炎、冠心病、心绞痛、高脂血症、神经衰弱、肝炎、白细胞减少症等病症[1]。近年来,对灵芝化学成分及临床作用的研究较多,其中对灵芝孢子的研究引起广泛关注。灵芝孢子含有比灵芝子实体更加丰富的多糖类、三萜类、脂肪酸类、氨基酸、多肽类、甾醇类、无机离子等活性成。现代药理与临床研究结果表明,灵芝孢子具有增强免疫、抗肿瘤、抗炎、保肝、降血清胆固醇、降血糖、抗辐射、抗病毒等功能,尤其在增强免疫、抑制肿瘤的药效方面远远超过灵芝子实体

  由于灵芝孢子的双层壁是由几丁质、纤维素、木质素和葡聚糖构成,且具有同心圆的层网结构,质地坚韧,耐酸碱、耐压、耐高温,极难分解,对消化酶也非常稳定。人体服用未破壁的灵芝孢子后极难被胃酸消化,也很难被肠道中的消化酶分解,导致有效成分很难被人体吸收利用。因此为了充分利用灵芝孢子内的有效物质,对孢子需进行破壁处理。目前虽有多种方法可对灵芝孢子进行破壁处理,如机械法、超声波破壁法、生物酶法等,但采用这些方法破壁的同时,仍然存在一些有待解决的问题,如破壁率不高,有效成分难以溶出等。因此,高效破壁技术已成为灵芝孢子制剂开发和利用的关键因素。笔者通过比较多种破壁技术的破壁效果及破壁工艺的优化,以期提高灵芝孢子的破壁率,促进有效成分的溶出,增强免疫力。

材料与方法

  试验材料ICR 雄性小鼠160 只,体重18~22 g,由扬州大学比较医学中心(SPF级)提供,动物质量合格证号:SCXK(苏)2012-0004。动物饲养于南京中医药大学动物中心SPF级小鼠实验室内,温度(23±2)℃,空气相对湿度55%±5%,颗粒饲料为汤山龙泉牌实验鼠颗粒饲料喂养,自由饮水。

  药品与试剂注射用环磷酰胺(德国百特制药公司);绵羊红细胞(南京森贝伽生物科技有限公司);豚鼠血清(南京森贝伽生物科技有限公司);熊果酸对照品购于成都普菲德生物技术有限公司(批号:141021,HPLC检验含量>98%);葡萄糖对照品购于上海融禾医药科技发展有限公司(批号:131118,HPLC检验含量>98%),其它试剂均为国产分析纯。

  试验仪器贝利超微粉碎机(济南倍力粉技术工程有限公司),超声波粉碎仪(JY92-IIN宁波新芝生物科技股份有限公司),球磨机(A5-05M,绍兴市东晶机械仪器设备有限公司),恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司),超纯水器(南京易普易达科技发展有限公司),酶标仪(PerkinElmer股份有限公司),电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司),海尔医用低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司)。

试验方法

  破壁率的计算采用血球计数板法,在200倍光学显微镜下计数破碎与未破碎的灵芝孢子,破壁率=([ A-B)/A]×100%(A为破壁前完整孢子数,B为破壁后完整孢子数)。

总三萜含量测定

  对照品溶液的制备称取熊果酸对照品适量,置于10 mL容量瓶中,加乙酸乙酯溶解,定容,摇匀,备用。得质量浓度为250 μg/mL熊果酸对照品溶液。

  供试品溶液的制备取破壁灵芝孢子粉0.1 g 置于100 mL 容量瓶,加入90 mL 乙酸乙酯超声提取30 min,冷却至室温后定容至100 mL,过滤,即得供试品溶液。

  测定方法精密量取供试品溶液2.0 mL置于10 mL具塞试管中,100 ℃水浴蒸干,加入5%香草醛-冰醋酸0.4 mL 和高氯酸1.0 mL 摇匀,于60 ℃水浴加热15 min,冰浴3 min后,加入5 mL 冰醋酸摇匀,放置15 min后于548 nm下测定吸光度。

总多糖含量测定

  对照品溶液的制备称取葡萄糖对照品适量,置于100 mL容量瓶中,加超纯水溶解,定容,摇匀,备用。得质量浓度为133.8 μg/mL葡萄糖对照品溶液。

  供试品溶液的制备精密称取破壁灵芝孢子粉0.5 g 置于100 mL 锥形瓶中,精密加入80%乙醇40 mL,静置2 h,超声提取30 min,过滤,滤渣连同滤纸共同烘干,加入超纯水100 mL,超声提取30 min,100 ℃水浴1 h后,过滤即得供试品溶液。

  测定方法精密量取供试品溶液1.0 mL,置于10 mL 具塞试管中,加水至2.0 mL,加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1 g,加80%硫酸溶液100 mL 溶解,摇匀)6.0 mL,摇匀,置水浴中加热15 min后,冰浴中冷却15 min,以相应的试剂为空白,在625 nm波长处测定吸光度。

破壁灵芝孢子粉的免疫活性

  免疫低下模型小鼠造模及给药将试验小鼠随机分成8组,设空白组、模型组、超微粉碎的破壁灵芝孢子粉给药组(高、中、低三个剂量)和未破壁灵芝孢子粉给药组(高、中、低三个剂量),每小组10只小鼠,正常组和模型组每天灌喂生理盐水0.1 mL/10 g,给药组以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组,另设二个剂量组,具体为:低剂量组0.15 g/kg,中剂量组0.3 g/kg,高剂量组0.6 g/kg。每天分别灌喂给药0.1 mL/10 g,共灌喂30 d。正常组腹腔注射生理盐水0.1 mL/kg,模型组和各给药组均于首次给药后第1、3、5、17 和19 d 腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg,每天1次,建立免疫功能低下小鼠模型。

  体重和免疫器官指数观察每4~5 d给小鼠称重并记录,按剂量灌喂、造模,眼眶采血等操作完成后处死小鼠,解剖取出脾脏和胸腺,分别用生理盐水漂洗后滤纸吸干,称重并按下式计算脏器指数。

  迟发型变态反应— 绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠DTH(足跖增厚法) 小鼠腹腔注射2%(v/ v)SRBC 进行免疫,每只鼠0.2 mL(约1×108个SRBC)。免疫后4 d,测量左后足跖厚度,然后在测量部位皮下注射20%(v/v)SRBC,每鼠20 μL(约1×108个SRBC),注射后于24 h 测量左后足跖部厚度,同一部位测量三次,取平均值。以免疫前后足跖厚度差值(足跖肿胀度)来表示DTH 的程度。

  血清溶血素的测定— 半数溶血值(HC50)测定法小鼠腹腔注射2%(v/v)SRBC进行免疫,每只鼠0.2 mL(约1×108个SRBC)。免疫后4 d,处死动物,小鼠眼眶取血,放置约1 h,使血清充分析出,2000 r/min离心10 min,收集血清,用生理盐水将血清稀释200倍。各组样品管中分别加入1∶200试验小鼠血清稀释液1 mL、1∶10 补体血清稀释液1 mL、以及10% SRBC 0.5 mL振荡混匀,另取空白管,分别加入等量的补体、SRBC及1 mL生理盐水。然后各管于37 ℃水浴锅中孵育10 min,冰浴10 min终止反应,2000 r/min离心10 min,取上清液,以空白管调零,在540 nm处测定各管OD值,记录结果。

  巨噬细胞功能的测定—小鼠碳廓清试验采用碳粒廓清法,造模与给药方法同1.4.4.1,连续给药30 d后,经小鼠尾静脉注入3倍稀释的印度墨汁100 mL/kg。分别于2 min 和10 min从眼眶后取血20 μL,并将其加入到2.0 mL 0.1% Na2CO3溶液中摇匀,在578 nm波长处测光密度值,OD1表示2 min的光密度值,OD2表示10 min的光密度值。

结果与分析

  不同破壁方法对灵芝孢子破壁率及有效成分溶出率的影响灵芝孢子破壁后,颜色加深呈现棕褐色。显微镜下观察未破壁的孢子壁光滑完整、丰满,结构清晰,个体形态一致,呈卵形;破壁后,孢子壁不完整、内容物呈不规则块状。采用超声波破碎法、球磨法、超微粉碎法三种不同的灵芝孢子破壁方法,随着破壁时间的延长,孢子破壁率呈现上升的趋势,在破壁时间达到45 min时,三种破壁方法的破壁

率基本上均达到最大值,其中超微粉碎破壁效果最好。随着破壁时间的延长,总三萜和总多糖含量呈现先增加后减少的趋势,30 min时总三萜和总多糖的含量达到最高值。其中超微粉碎破壁法更有利于灵芝孢子有效成分的溶出。综合分析破壁率和有效成分的含量,采用超微粉碎破壁法,破壁时间30 min,破壁率达到96.97%,总三萜和总多糖的溶出量分别为34.16 mg/g和33.88 mg/g,分别比未破壁(总三萜13.13 mg/g±0.72 mg/g和总多糖6.91 mg/g±0.46 mg/g)提高了160.2%和390.0%。

  通过考察不同的破壁技术对灵芝孢子破壁率及有效成分溶出的影响,结果显示超微粉碎法效果较好,且破壁灵芝孢子粉可显著改善免疫低下小鼠脾脏的损伤,延缓迟发型变态反应,增加单核-巨噬细胞吞噬功能和血清溶血素含量,免疫增强效果明显优于未破壁的灵芝孢子粉。








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