宁波新芝生物科技股份有限公司
蛹虫草多糖具有多种药理作用 ，如抗氧化 、免疫调节 、降血糖 、消炎和抗癌等 .由于多糖分子量较大且结构复杂 ，因此对其结构表征难度较大 ，目前多采用色谱和光谱等方法获得多糖的分子量 、单糖组成及三级结构等信息 ，但过程复杂.分析多糖中单糖组成的方法较多 ，其中水解法使多糖中单糖相互间连接的糖苷键断裂 ，释放出单糖 ，再用色谱法对单糖进行定性定量分析 .常用的水解方法有硫酸水解法 、盐酸水解法和三氟乙酸水解法等 .本文用超声水提法提取白虫草多糖 .以单因素实验为基础 ，分析各提取因素对白虫草多糖得率的影响 ，再用响应面法优化各研究因素间的交互作用 ，最终确定白虫草多糖的最佳提取工艺参数 .通过高效液相色谱（HPLC）法对白虫草多糖的成分进行检测 ，鉴定其主要单糖组成 ，并用 RAW264 .7 体外细胞抗炎模型对白虫草多糖的抗炎效果进行检测 .
实 验
材料和仪器
白虫草产自吉林省白山市板石岭长白山山脉 ；RAW246 .7 细胞由长春工业大学生物工程实验室提供 .紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司） ； HPLC 仪（美国沃特世公司） ；超声提取装置（宁波新芝生物科技股份有限公司） ；酶标仪（济南鑫贝西生物技术有限公司） ；细胞抗炎试剂盒（武汉默沙克生物） .
白虫草多糖的提取
称取 50 g 白虫草超微粉末置于烧杯中 ，加蒸馏水 500 mL ，搅拌均匀 ，以 20 ℃ ，1 000 W 超声3 .0 h .超声结束后先用纱布粗滤 ，再离心 ，将上清液浓缩至 200 mL ，于 4 ℃ 冷藏 .取浓缩后的上清液加入无水乙醇搅拌至溶液总体积为 1 L ，即乙醇的体积分数为 80％ ，静置 24 h .将醇沉后的沉淀收集 、干燥 ，得到白虫草多糖 .分别对提取温度 、超声波功率 、提取时间和料液比（m（料） ∶ V （液））进行单因素实验 ，每个因素分 3 组进行平行实验 ，通过响应面法确定最佳提取工艺 ，其中提取率 ＝ [粗多糖质量（g ）/原料质量（g ）] × 100％ .
白虫草多糖的分离纯化
将 200 g 白虫草多糖超声溶解于蒸馏水中 ，搅拌均匀后样品于 500 r/min 离心 10 min ，除去不溶物 ，取上清液加样到 DEAE Sepharose 色谱柱（20 mm × 300 mm）中 ，用蒸馏水及 0 .05 ，0 .1 ，0 .2 mol/L的 NaCl 溶液分别洗脱 240 min ，收集洗脱液（每管 5 mL ，1 mL /min） ，用苯酚-硫酸比色法在 490 nm处测定洗脱液 A 值（OD 值） ，绘制洗脱时间与 A 的关系曲线 .收集单一对称峰 ，透析除去 NaCl ，浓缩后进行冷冻干燥 .重复上述分离操作以得到足够的多糖样品 .
白虫草中多糖的质量分数测定
用苯酚-硫酸比色法测定样品中总糖的质量分数 ，以葡萄糖标准品为对照品 ，绘制葡萄糖的质量浓度 ρ（mg /mL）与吸光度（A）间的标准曲线 ，测定白虫草多糖中总糖的质量分数.用咔唑-硫酸比色法测定多糖糖醛酸的质量分数 ，以葡萄糖糖醛酸为对照品 ，绘制标准曲线 ，测定白虫草多糖中糖醛酸的质量分数 .用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的质量分数 ，以牛血清白蛋白为标准对照品 ，绘制标准曲线 ，测定白虫草多糖中蛋白质的质量分数.
