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龙眼肉超微粉碎提取法

[导读]分别选取超声时间、酶添加量和提取时间 3 个因素对超微粉碎纤维素酶辅助提取工艺进行优化。 通过分析多糖基本成分、分子质量、黏度、溶解度等比较热水浸提法、超微粉碎辅助法和超微粉碎纤维素酶辅助法 3 种方法制得的龙眼果肉多糖(LP、LP-S、LP-SE)的理化特性。 通过分析对巨噬细胞分泌细胞因子的刺激作用,比较 3 种龙眼果肉多糖的免疫活性。

龙眼俗称 “桂圆”, 是传统药食两用水果,据 《神农本草经》、《本草纲目》等古医书记载,其具有 养血安神、益智宁心、补益心脾、壮阳益气、延年益 寿等功效。 现代研究发现,水溶性多糖是其果肉 的主要活性成分之一,具有免疫调节、抗肿瘤、 抗氧化和抗炎等多种功能活性。 基于龙眼生物 活性机制的研究及其开展精深加工的需要, 开展 龙眼果肉多糖的提取技术研究显得至关重要。 超微粉碎技术是近期出现的一种提取技术, 其可以将原料粉碎至 1nm~100μm 粒径的微小颗 粒,从而改变原料表面结构,增加原料与提取剂的 接触面积,实现高效提取。 超微粉碎因具有高效、 节能等特点而逐渐被应用于功能性成分的提取制 备。 有研究表明超微粉碎辅助提取多糖能改变多 糖的分子质量、化学组 成 等,从而影响其生物活 性,然而,超微粉碎技术对龙眼果肉多糖的理化 性质及其免疫调节活性的影响尚鲜见报道。 此外, 生物酶解技术因具有特异性、 高效性被应用于活 性多糖的提取。 等分别优化建立了 超声波-酶解、酶法提取龙眼多糖的工艺,而对生物酶解与物理的超微粉碎相结合后, 两者对龙眼 多糖的得率、 理化性质及其免疫活性的影响尚不 知晓。 本研究比较了热水浸提法、超微粉碎提取法 和超微粉碎-酶法提取技术对龙眼果肉多糖的提 取率、理化性质以及免疫活性的影响。

材料与方法

  材料与仪器 龙眼品种“储良”,由广东省农业科学院果树 研究所提供,于 2016 年 9 月采自其实验果园。 新 鲜龙眼采用热风干燥得到龙眼干。 葡萄糖醛酸、葡聚 糖、葡 萄 糖、木 糖、阿 拉 伯 糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖标准品,甲基噻唑基四 唑 (MTT), 纤 维 素 酶 (Cellulase from Aspergillus niger,Sigma-22178),脂多糖(LPS)和青链霉素,购 自美国 Sigma 公司;间羟基联苯,购自日本 TCI 公司;NO 试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒,购自 南京建成科技有限公司;TNF-α、IL-6 和 IL-1β 酶 联免疫试剂盒, 购自深圳欣博盛生物科技有限公 司;其它试剂均为国产分析纯。 小鼠巨噬细胞株 RAW264.7 由中国科学院典 型培养物保藏委员会细胞库提供, 本实验室继代 培养。

  UV-1800 紫外可见分光光度计, 日本岛津有 限公司;振动式细胞级超微粉碎机,济南达微机械 有限公司;冷冻干燥仪宁波新芝生物科技股份有限公司; GHRH-20 热泵干燥机, 广东省农业机械研究所; Eyelan-1100 旋转蒸发器, 东京理化器械株式会 社;Infinite Pro 200 酶标仪, 瑞士 Tecan 公司;气 相 色 谱 - 质 谱 联 用 仪 , 美 国 Agilent 公 司 ; AR1500EX 流变仪, 美 国 TA 公 司;Acquity APC 超高效聚合物色谱系统,美国 Waters 公司。 1.2 试验方法 1.2.1 龙眼果肉多糖的提取 将龙眼干用 80%的 乙醇浸泡 5 次脱去小分子糖后 50 ℃烘干 72 h,超 微粉碎处理后,按料液比 1 ∶ 40(mg/mL)加入蒸馏 水,匀浆,调节 pH 值,添加适量纤维素酶,浸提一 定时间后,升温至 90 ℃灭酶 5 min 后过滤,得到龙 眼多糖提取液。 提取率的计算: 多糖提取率=(提取液中总糖 质量-提取液中还原糖质量)/龙眼干质量×100%。 总糖含量采用苯酚-硫酸法,还原糖含量采用 DNS 法。

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