新芝超声-植物叶片染色质免疫共沉淀方法的优化

  迄今为止，已有多种方法用于研究蛋白质与 DNA 的互作，染色质免疫共沉淀技术( Chromatin immunoprecipitation，ChIP) 是用于检测蛋白质与 DNA 体内互作的有力工具．自创建 ChIP 技 术以来，ChIP 方法得到不断改进和完善．ChIP 技术可与高通量测序( seq) 、基因芯片( chip) 、实时荧光定量 PCＲ( qPCＲ) 等技术联合使用，广泛应用于组蛋白修饰、核小体定位及转录因子结合位点检测等方面． ChIP 技术的基本原理是在生物体生理状态下，利用甲醛使细胞核内 DNA 和蛋白质紧密交联，通过超 声或酶试剂处理将染色质剪切成 200 ～ 1 000 bp 的小片段，利用特异性抗体沉淀与靶标蛋白结合的 DNA， 最后解交联并纯化 DNA 片段．虽然 ChIP 技术应用日趋广泛，但 ChIP 试验步骤繁琐，多个因素限制了 ChIP 的效率．其中超声破碎条件和免疫沉淀效率是影响该试验能否成功的关键因素．样品量、破碎时间、 功率及破碎强度等均能影响超声破碎效率．以西红柿为材料，探索不同功率对染色质片 段大小的影响，结果显示功率为 20%时染色质片段最小最集中．与其他植物相比，拟南芥 ChIP 方法研究较为深入．较系统地探索了超声破碎仪的破碎时间、功率、间隔时间对拟南芥染色质片段大小的 影响．利用另一型号超声破碎仪，优化了拟南芥野生型和突变体幼苗的 ChIP 方法．但是不同超声破碎仪器的条件需要重新设定和优化，并且不同植物其破碎条件也不尽相同．此外，抗体的亲和性和用 量也是限制免疫沉淀效率的重要因素，因此不同样品量对不同抗体的用量需要进一步确定． 植物染色质构象变化参与调控植物的发育、衰老和胁迫响应过程，组蛋白修饰作为一种重要的染色质 重塑机制之一，对基因的表达和抑制具有重要的调控作用．利用 ChIP 技术可以研究特定基因以及全基 因组范围的组蛋白修饰的变化．本试验以拟南芥成熟莲座叶为材料，比较和优化不同超声破碎仪器的破 碎条件，同时探索了组蛋白 H3 第 9 位赖氨酸乙酰化( H3K9ac) 抗体的用量对免疫效率的影响．利用上述最 适的超声破碎仪条件和 H3K9ac 抗体用量，以水稻旗叶为材料进行 ChIP 试验，获得的 DNA 片段可以成功 用于后续的实时定量 PCＲ( ChIP-qPCＲ) 和高通量测序( ChIP-seq) 分析．

材料与方法

材料

  植物材料 植物材料是在人工气候室培养的野生型拟南芥( Arabidopsis thaliana L． Columbia ecotype) 和水稻日本晴品种( Oryza sativa L． cv． Nipponbare) ． 拟南芥生长条件为: 温度 22 ℃，相对湿度 60% ＲH，光照时间 13 h，黑暗时间 11 h．选取抽薹后完全展 开的莲座叶( 约 7 周) 作为试验材料．水稻生长条件为: 温度 28～32 ℃，光照时间 16 h，黑暗时间 8 h．水稻小 穗完全从叶鞘中抽出时，取其旗叶作为第 1 周的试验材料，以后每隔 1 周取材 1 次，共取 6 次，分别记作 1 周、2 周、3 周、4 周、5 周、6 周． 1．1．2 仪器与试剂 本试验所使用了 3 种超声破碎仪器，分别为: scientz08-II ，Scientz08-III、Scientz-IID．其中 Scientz-IID 为探头式超声破碎仪，而其他两 种破碎仪器为非接触式超声破碎仪． 荧光定量 PCＲ 仪型号: CFX Connect( BioＲad) ． Microcloth( 475855-1ＲCN) 、蛋白酶抑制剂 Complete Protease Inhibitor Cocktail( 04693116001) 购自罗氏 公司、抗体 H3K9ac( 07-352) 购自默克密理博公司．