宁波新芝生物科技股份有限公司
【研究意义】蜂王浆是由工蜂上颚腺和咽下腺等腺体共同分泌的乳白色或淡黄色的浆状物质，是工蜂用来饲喂 1—3 日龄蜜蜂幼虫和饲喂蜂王终生的食物。蜂王浆是一种对人类健康具有重要作用的天然功能食品，具有调节血压、增强免疫力、抗菌消炎、抗肿瘤等药理功效，其营养价值越来越受到人们的关注。蜂王浆成分复杂，主要包括水分、蛋白质、脂类、氨基酸、糖类、维生素等，其丰富的生物活性成分是蜂王浆具有医疗保健功效的物质基础。代谢组学是对生物体、器官、组织或细胞中的代谢物进行全面系统鉴定和分析的技术，该技术在食品领域的应用，可对食品中的小分子组分进行整体定性和定量分析，为食品质量安全提供技术支撑。代谢物的提取是代谢组学研究中至关重要的步骤，直接影响了可检测的代谢物范围以及代谢物提取的数量。因此，建立简单易行且高效的蜂王浆代谢物的提取方法，获得更加全面的代谢物种类和数量，对蜂王浆质量评价和功能开发利用具有重要意义。
【前人研究进展】目前对蜂王浆小分子化合物的鉴定分析已有大量报道，检测了蜂王浆中的挥发性成分和有机溶剂萃取成分，靶向测定了蜂王浆中的亲水性化合物，但大多数研究只针对蜂王浆中的某一类化合物，如氨基酸、糖、有机酸、维生素及核酸。从分析方法来看，以上研究主要基于气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）、气相色谱火焰-离子化检测器（GC-FID）、高效液相色谱-荧光检测技术（HPLC-FLD）等。气相色谱相关技术检测范围小，只能检测挥发性化合物和衍生化后形成的挥发性化合物。超高效液相色谱-高分辨质谱技术（UPLC-HRMS）具有更高的分辨率和灵敏度，通过选择不同的分离色谱柱可以实现从非极性到极性代谢物的全面检测，其中反相液相色谱（reversephase liquid chromatography，RPLC）能够很好地分离非极性和中低极性化合物，但对强极性化合物的保留和分离能力较弱，而亲水相互作用色谱（hydrophilicinteraction liquid chromatography，HILIC）对强极性化合物有较好的分离和保留，具有与 RPLC 互补的选择性。因此，RPLC 和 HILIC 相结合可以扩大代谢物的分离检测范围，与质谱联用后可获得更全面的代谢物种类及含量的信息。但 UPLC-HRMS技术在蜂王浆代谢物研究中的应用非常有限，而且只进行了靶向分析，非靶向的 RPLC-HRMS 和HILIC-HRMS 以及二者同时应用到蜂王浆中的研究还未有报道。代谢组学研究中，溶剂提取法是广泛使用的代谢物提取方法，目前常用的样品提取溶剂有甲醇、乙醇、乙腈以及与水组成的混合溶剂提取体系，不同溶剂对代谢物的提取会产生不同的影响。蜂王浆代谢成分复杂，化学性质和丰度差异大，提取溶剂的选择至关重要，目前常用的提取溶剂有90%乙醇、50%甲醇、100%甲醇及 50%乙腈等，但缺乏系统的比较研究。
【本研究切入点】分别基于 RPLC 和 HILIC 联合 Q-Exactive OrbitrapHRMS 以及代谢组学分析技术对蜂王浆中的小分子化合物进行全面分析，通过多元统计分析比较不同浓度（50%和 80%）的甲醇、乙醇和乙腈对蜂王浆代谢物的提取效果，优化蜂王浆代谢物的提取方法。
【拟解决的关键问题】建立并优化蜂王浆小分子化合物成分的高效提取方法，对蜂王浆中的小分子化合物进行全面解析，为后续蜂王浆代谢组学研究提供技术支持。
材料与方法
试验于 2019 年在中国农业科学院蜜蜂研究所完成。
化学试剂
质谱级乙腈（A955-4）、质谱级甲醇（A456-4）、质谱级乙醇（24102）、色谱级甲酸（50144）和甲酸铵（A115-50）购自 Fisher Scientific，超纯水由 Milli-Q纯水机制备，化合物标准品购自 Sigma。
仪器设备
质谱仪（ Q-Exactive ），美国 Thermo FisherScientific 公司；超高效液相色谱系统（Ultimate 3000），美国 Thermo Fisher Scientific 公司；台式低温离心机（Microfuge 22R Centrifuge），美国 BeckMAN CoulTER公司；电子分析天平（PL203，0.1 mg），德国 METTLERTOLEDO 公司；超低温冰箱（MDF-U3286S），日本SANYO 公司；非接触超声波细胞粉碎机（Scientz08-III），宁波 SCIENTZ 公司；快速低温冷却循环机（DLK-2007），宁波 SCIENTZ 公司。均采用宁波新芝生物科技股份有限公司生产。
